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污泥中胞内外DNA的分离方法及其携带耐药基因的检测方法

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成果类型:
专利
发明/设计人:
周帅;张雨;高媛媛;唐振平;刘金香
申请/专利权人:
南华大学
专利类型:
发明专利
语种:
中文
申请时间:
2020-03-30
申请/专利号:
CN202010240059.3
公开时间:
2020-06-05
公开号:
CN111235146A
主申请人地址:
421001 湖南省衡阳市蒸湘区常胜西路28号
申请地区:
湖南
机构署名:
本校为第一完成单位
主权项:
1.分离污泥中胞内外DNA的方法,其特征在于,包括: 污泥沉淀与活化后的阳离子交换树脂混合,0~4℃500~800rpm搅拌反应4~8h后,离心分离上清液a和沉淀a; 所述上清液a经醋酸纤维膜过滤,获得污泥胞外DNA粗提取液; 所述沉淀a与胞内DNA抽提缓冲液混合,依次经蛋白酶K酶解、20wt%十二烷基苯磺酸钠处理、20wt%十二烷基苯磺酸钠-DNA抽提缓冲液处理后,分离上清液b,获得污泥胞内DNA粗提取液。 2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述阳离子交换树脂为Dowex Marathon C钠型,每g挥发性污泥混合液悬浮固体与60~80g所述阳离子交换树脂混合。 3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述沉淀a与DNA抽提缓冲液和蛋白酶K混合,酶解后经三次十二烷基苯磺酸钠处理; 所述三次十二烷基苯磺酸钠处理包括: 第一次处理:酶解产物与20wt%十二烷基苯磺酸钠溶液混合,65℃孵育2h后,10000rpm离心10min,分离沉淀和上清液c; 第二次处理:将第一次处理后的沉淀与20wt%十二烷基苯磺酸钠溶液-DNA抽提缓冲液混合,65℃孵育10min后,10000rpm离心10min,分离沉淀和上清液d; 第三次处理:将第二次处理后的沉淀与20wt%十二烷基苯磺酸钠溶液-DNA抽提缓冲液混合,65℃孵育10min后,10000rpm离心10min,取上清液e; 合并上清液c、d、e为上清液b。 4.根据权利要求1~3任一项所述的方法,其特征在于,所述污泥胞外DNA粗提取液依次经十六烷基三甲基溴化铵、高盐TE缓冲液、异丙醇、苯酚-氯仿-异戊醇、氯仿-异戊醇处理后,以乙酸钠-无水乙醇沉淀,再以70vol%乙醇洗涤,获得胞外DNA。 5.根据权利要求1~4任一项所述的方法,其特征在于,所述污泥胞内DNA粗提取液依次经苯酚-氯仿-异戊醇、氯仿-异戊醇处理后,以异丙醇沉淀后,再以70vol%乙醇洗涤,获得胞内DNA。 6.根据权利要求1~5任一项所述的方法,其特征在于,所述提取过程中,以活/死细胞染色法评估胞外DNA是否受到胞内DNA的污染。 7.一种污泥中胞内外耐药基因的检测方法,其特征在于,以权利要求1~6任一项所述的方法分离污泥中胞内外DNA;分别以目的耐药基因的引物进行扩增,根据扩增结果分析污泥中胞内外耐药基因的存在情况。 8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,所述耐药基因包括:sul1、sul2、tetC、tetM、tetO和tetX。 9.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,所述扩增的体系包括: 所述扩增程序包括: 50℃尿嘧啶-DNA糖基化酶处理2min; 95℃ Dual-LockTM Taq DNA聚合酶热启动2min; 95℃变性15s,退火15s,72℃延伸1min,共40个循环。
摘要:
本发明涉及污水处理技术领域,尤其涉及分离污泥中胞内外DNA的方法及污泥中胞内外耐药基因的检测方法。本发明提供的方法联合离子交换树脂法和十二烷基苯磺酸钠‑高盐法提取污泥胞外、胞内DNA,该方法提取获得的胞内外DNA无明显交叉污染。采用特异性引物对提取产物扩增,可成功区分污泥中胞内外耐药基因,有望用于探究污泥中不同形态耐药基因的时空分布特征,并为今后开发相应的耐药基因风险评估方案和消除手段提供依据。

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